Органоферма в лабораторії або як побудувати справжній мозок

В уяві письменників-фантастів нерідко постають справжнісінькі господарства з вирощування людей. Реальність не встигає за такими мріями. Нині ми не здатні культивувати навіть повноцінні органи, що вже говорити про цілі організми. Та все починається з малого, і вчені сьогодення активно працюють над формуванням у лабораторних умовах тканин людського організму. Більше цікавого – в адаптованому перекладі інформації з ресурсу Sciencenews.

Створи мені орган

Протягом багатьох десятиліть біологічні дослідження спираються на клітинні лінії, вирощені у чашках Петрі в один шар, але ці шари не мають структурної складності живих тканин. Тож дійсно революційними свого часу стали роботи, які відкрили перед науковцями магію стовбурових клітин, що множилися та зростали у тривимірному форматі, вільно плаваючи у рідині. Частинки органоподібної тканини можна генерувати зі стовбурових клітин, які отримують або з ембріонів, або відбирають зі шкіри та крові дорослої людини, хімічно спонукаючи їх повернутися до стану, подібного до зародкового. Стовбурові клітини зустрічаються у багатьох органах (включно з головним мозком), мають здатність самовідновлюватися шляхом поділу, таким чином відновлюючи пошкодження, а також можуть диференціюватися у досить велику кількість спеціалізованих типів клітин, хоча діапазон таких типів – обмежений.

Нині поширеною стала наукова тенденція, яка має на меті змусити людські стовбурові клітини самостійно збиратись у «клубки» органоподібної тканини, що звуться органоїдами, розмір яких, як правило, не більший за горошину. Хоча наразі вчені ще не можуть культивувати досить великі органоїди, аби відтворювати цілі людські органи, ці міні-версії можуть імітувати тривимірну клітинну інфраструктуру будь-якої тканини людського організму – від кишківника до легенів, а це відкриває перед науковцями неймовірні можливості, адже подібну клітинну структуру не отримаєш, досліджуючи гризунів, біологія яких відрізняється від людської.

Моделі міні-органів обіцяють величезні переваги для розуміння основних процесів біології людини та процесів захворювань, пропонуючи точне випробувальне поле для пошуку або перевірки медикаментозної терапії; а створюючи персоналізовані органоїди з перепрограмованих клітин пацієнтів, учені могли б вивчати хвороби індивідуально чи навіть використовувати органоїдні структури для заміни певних пошкоджених тканин. Сьогодні у лабораторіях в усьому світі культивують крихітні шматочки людських шлунків, печінки, нирок, легенів тощо.

«По суті, ми відкриваємо можливості стовбурових клітин. Ми трохи підштовхуємо [клітини], і вони роблять те, що добре вміють», – говорить Ханс Клеверс (Hans Clevers) з Університету в Утрехті, Нідерланди, який є президентом Міжнародного товариства досліджень стовбурових клітин. У 2009 році його лабораторія несподівано створила мініатюрну версію кишківника, культивуючи дорослі стовбурові клітини, які команда науковців виявила в тканині кишківника миші. Вирощені у краплі Матригеля (желатиноподібної матриці білків), ці клітини об’єднались у маленькі кулі з крихітними проекціями, які нагадували ворсинки, що поглинають поживні речовини в кишківнику.

Лабораторна хитрість полягає у точному знанні того, які інгредієнти можна використовувати для створення різних органів. Часто для визначення таких факторів дослідники спочатку експериментують зі стовбуровими клітинами інших організмів, приміром, гризунів.

Деякі вчені мріють про використання органоїдних методів вирощування повнорозмірних нирок або печінки в лабораторії для трансплантації. Більш досяжною метою може бути регенеративна трансплантація тканин, наприклад, заміщення клітин печінки, які відмирають, в осіб на ранній стадії захворювань цього органа на здорові стовбурові клітини з персоналізованого органоїда печінки, або імплантація шматочків органоїдної кишки пацієнтам, яким видалили частину кишківника. У Нідерландах, на підставі досліджень, представлених у 2016 році, Клеверс з колегами вже використовують персоналізовані органоїди кишківника, отримані за допомогою ректальної біопсії, для перевірки того, чи хворі на кістозний фіброз отримують користь від застосовних ліків.

Цілься вище або рівняння на мозок

Починаючи з середини 2000-х років, команда Йошікі Сасаї (Yoshiki Sasai) з Центру розвитку біології RIKEN в Кобе, Японія, демонструвала, як вирощувати мозкові структури з використанням ембріональних стовбурових клітин, спочатку мишей, а потім і людей. У своєму новаторському дослідженні в 2013 році дослідники використали хімічні сигнали для направлення людських ембріональних стовбурових клітин, аби сформувати специфічний регіон кори головного мозку. За кілька місяців до публікації цієї роботи Мадлен Ланкастер (Madeline Lancaster) та Юрген Нобліх (Juergen Knoblich) з Інституту молекулярної біотехнології у Відні, Австрія, та колегами з Великобританії продемонстрували свій підхід до розвитку органоїдів головного мозку. За допомогою їх методу людські плюрипотентні стовбурні клітини можуть спонтанно зібратись у крихітну структуру, що нагадує мозок, утворюючи будь-які структури мозку «на розсуд» самих стовбурових клітин. Відтоді дослідники з нетерпінням розвивають інші методи створення цих мініатюрних моделей мозку, подібно до шеф-кухарів, які вдосконалюють свої улюблені рецепти.

«Процес подібний до випічки торта: існує безліч способів досягти кінцевої мети», – роз’яснює біолог і невролог Беннетт Новіч (Bennett Novitch), керівник лабораторії в Каліфорнійському Університеті, який вважає за краще використовувати японський метод, але з деякими особливостями. Людський мозок набагато складніший, ніж будь-який інший орган, і навряд чи науковцям вдасться побудувати повну його копію. Але уже створені крихітні варіанти декількох ділянок мозку, починаючи від гіпоталамуса, який регулює температуру тіла, спрагу та голод, до базальних гангліїв, які контролюють рух. У будь-якому випадку органоїди відкривають нові наукові горизонти.

«– Органоїди надають безпрецедентний рівень доступу до внутрішніх процесів людського мозку», – пояснює Новіч, зазначаючи, що наш мозок значною мірою виходить за рамки доступних нам досліджень.

Якщо вченим вдасться вивчити точні моделі робочих нервових схем у мозкових шматочках, то дослідники, нарешті, зможуть розпочати працювати з унікальними людськими неврологічними станами, наприклад, такими розладами, як епілепсія, шизофренія чи аутизм. Саме органоїдні експерименти допомогли підтвердити досягнуті у ході інших досліджень припущення, що вірус Зіка націлюється та вбиває так звані ORG-клітини – зовнішні радіальні гліальні клітини, що є нейронними стовбуровими клітинами, які є ключовими для побудови надзвичайно великої кори (ці клітини є типовими для людського організму та майже не зустрічаються у гризунів), та інші клітини-нейрони, а це сприяє зменшенню розміру мозку у заражених вірусом немовлят. У дослідженні 2016 року вчені з Університету Джонса Гопкінса Го-лі Мін (Guo-li Ming) та Гон-юн Сон (Hongjun Song) представили свої власні методи створення частинок мозку, які мають чітко визначену зону ORG-клітин. Після зараження цих органоїдів вірусом Зіка дослідники спостерігали колапс кортикальної тканини, яка частково пояснює розростання головного мозку.

Обмеження

Одне з численних обмежень лабораторних методів полягає в тому, що органоїди утворюються повільно, більш-менш наслідуючи ту саму шкалу розвитку, що і людський мозок під час вагітності. Але без кровопостачання частинки мозку досягають лише кількох міліметрів у розмірі. Це означає, що органоїдним моделям часто бракує клітин з пізніх етапів розвитку, як от клітин, які називаються астроцитами. Ці клітини у формі зірки мають вирішальне значення для створення зв’язків між нейронами та керування ними, а також беруть участь у формуванні спогадів. Астроцити не дозрівають у мозку дитини до її безпосереднього народження. Але фахівець з нейрології Стенфордського університету Серджіу Пашка (Sergiu Paşka) створив спосіб виготовлення та підтримання 4-міліметрових кульок тканини кори головного мозку людини (він називає їх сфероїдами) протягом тривалого часу. У серпні минулого року його команда описала органоїди, які жили понад 20 місяців, досить довго для того, як підтвердили аналізи, щоб астроцити дозріли та могли функціонувати таким чином, що імітує їх аналоги у реальному мозку. Пашка також почав збирати різні типи міні-моделей мозку, мов конструктор: помістивши їх у сприятливі умови у процесі термоядерного синтезу, дослідники зняли відео довгих, подібних до спагеті клітин, які називаються інтернейронами, що мігрують зі сфероїда одного типу до сфероїда іншого типу.

«– Вони не повзуть один до одного, а стрибають, ніби точно знають, куди їм треба» – пояснює автор дослідження.

Відсутність вбудованого кровопостачання також є причиною проблеми поглинання достатньої кількості кисню та поживних речовин з рідини, у якій ростуть міні-органи. З цією метою у деяких лабораторіях рідину навколо тканин циркулюють, в інших – клітини ділять навпіл (деталі – нижче).

Дослідження все ще перебувають на ранній стадії. Попри захопливу динаміку дослідження іноді перебільшують ступінь, в якому органоїди людського мозку відтворюють особливості тканини мозку, що розвивається, вважає біолог зі стовбурових клітин Арнольд Крігштейн (Arnold Kriegstein) з Каліфорнійського університету у Сан-Франциско. Міні-моделям все ще бракує багатьох основних компонентів. Інший вагомий недолік полягає в тому, що різні партії мозкових органоїдів навіть у межах однієї лабораторії можуть сильно відрізнятись. «Важливо зосередити увагу на відтворюваності та можливості отримати підхід, який гарантуватиме однаковий результат кожного разу», – говорить Крігштейн.

Розуміймо краще: один зі способів «будівництва» мозку

Методи виготовлення шматочків мозкової тканини засновуються на природженій тенденції людських плюрипотентних стовбурових клітин до утворення нервової тканини. Ось короткий опис одного з можливих лабораторних процесів:

  • День 0: близько 9 000 стовбурових клітин переносяться у V-подібні контейнери та опускаються у спеціальну хімічну суміш – своєрідний коктейль з вітамінів, амінокислот та (протягом перших шести днів) Y-27632, хімічної речовини, яка перешкоджає самогубству стовбурових клітин. Протягом кількох днів клітини множаться та самі собою агрегуються у крихітні кульки нервової тканини. Розчин оновлюється кожні два-три дні.
  • День 18: нервові скупчення, що продовжують зростати, переносять у чашки Петрі з іншою рідиною, яка містить CDLC, доповнення, що забезпечує надходження жирів. Високі рівні кисню (40% кисню, 5% двоокису вуглецю) допомагають тканині поглинати достатньо кисню. На 4-5 тиждень чітко окреслені кластери або розетки показують ранні шари різних типів нервових клітин, що розвиваються.
  • День 35: органоїди мозкової тканини, ширина яких досягла 2-3 мм, розрізають навпіл, щоб дати клітинам більше доступу до поживних речовин і кисню. Частина клітин помирає у результаті такого втручання, інша ж продовжує рости та розвиватись. Скупчення тканини вирощують у новому розчині, наповненому стимуляторами росту: желатиноподібною матрицею білків під назвою Матригель, вітамінною добавкою B27, гепарином і генератором росту LIF.

На восьмому тижні у мозкових клітинах (зверху) з’являються нервові кластери, що називаються «розетками». У межах одного кластера (внизу, збільшений червоний квадратик) стовбурові клітини (сині) виділяють шари попередників нейрогенних клітин (рожевий) та нейронів (не забарвлені)

  • День 56: в органоїдів з’являються темніші скупчення нейронних «розеткоподібних структур», які нагадують архітектуру людського мозку плода на 14 тижні вагітності. Органоїди знову ділять навпіл і переносять у нові чашки Петрі, зроблені з киснево-проникного пластику, для оптимізації доступу до кисню для здорового росту. З цього моменту органоїди ділять навпіл приблизно кожні 2 тижні. Зазвичай вони виживають до 150 днів.

БІЛЬШЕ НА ЦЮ ТЕМУ:

Джерело: Sciencenews, переклад підготувала Ірина Гоял, спеціально для «Блог Imena.UA»